关于外泌体纯化方法，国际细胞外囊泡协会（ISEV）的最小实验要求（MISEV2023）中根据不同的原理进行外泌体分离时，每种方法均有优缺点：

MISEV2023中关于基于试剂盒分离EV的建议

分子尺寸排阻色谱法SEC在诸多分离方法中一骑绝尘，因其优良的性能脱颖而出，获得广大EVs领域专家的青睐，在EVs专刊JEV中的研究占比日益提高。
恩泽康泰开发的基于SEC原理的外泌体分离纯化专利产品——Exosupur^®试剂盒，自推出以来经受了市场和EVs领域专家的检验，在操作简便性、性能、稳定性和性价比上获得一致好评。

1. 可兼容常量或微量血浆/血清等复杂生物样本；

2. 可用于复杂生物样本的高通量测序、质谱等组学研究，以及下游的PCR、WB、WLISA验证等，纯度更高，杂质干扰更少，定量更准确；

3. 可用于细胞、动物的功能机制研究，不影响外泌体性质和活性、不引入聚集和其他杂质等影响；

4. 可用于工程化外泌体改造后再次纯化等研究；

5. 可用于纯化相关的方法学开发中作为对照方法使用。

1. 操作简便：无需特殊设备，柱平衡、上样、外泌体收集、外泌体浓缩4步操作，从上样到分离完成仅需30min；

2. 性能优越：对于常量血浆样本Exosupur^®1ml血浆/清排阻柱可回收最高达95%的荧光脂质体，杂蛋白去除率高达99.5%；微量血浆/清排阻柱可回收高达94%纳米颗粒，杂蛋白去除率平均为98%；

3. 稳定性高：只回收固定尺寸范围的外泌体，产物粒径范围窄；实验受外界因素波动的影响比较小；不引入其他的物理化学因素，可以保持完整的外泌体形态和功能；

4. 性价比高：可对排阻柱进行清洗再生，重复5次使用，可处理的样本量大；

5. 质量可靠：Exosupur^®系列sEV纯化试剂盒高效便捷，已辅助客户发文70篇+，经受了行业专家的检验，获得北京市新技术新产品认定。

Exosupur^®分离的血浆或微量血浆小细胞外囊泡sEV TEM电镜、WB和nanoFCM粒径表征。

Exosupur^®1ml血浆/清排阻柱对于血浆样本可回收最高达95%的荧光脂质体，杂蛋白去除率高达99.5%；微量血浆/清排阻柱可回收高达94%纳米颗粒，杂蛋白去除率平均为98%；

下左图为1ml血浆/清排阻柱(ES9P14e、ES9P11e)分离1mL血浆sEV效果，下右图为微量血浆/清排阻柱(ES9P021e、ES9P024e)分离0.2mL微量血浆sEV的效果。

下第2排图片，Western Blot中可以看出血浆中主要的miRNA结合蛋白更少，杂蛋白更少。高纯度外泌体更有利于RNA组学、蛋白组学及细胞功能学和在体实验研究。

通过分离的血浆sEV particle数与蛋白含量比值评估外泌体纯度，结果显示Exosupur®分离的外泌体纯度更高，杂蛋白含量更低。

数据来自于J Transl Med. 2021 Mar 12;19(1):104. 

对于低表达量的长RNA， Exosupur®能够得到更高丰度的长链RNA，更有利于mRNA + LncRNA研究。

数据来自于J Transl Med. 2021 Mar 12;19(1):104. 

对于miRNA，由于Exosupur^®富集的外泌体得率更高、纯度更高，使得富集于sEV的miRNA定量值更高，而非富集miRNA定量值非常低，能够更准确分析sEV来源miRNA。

数据来自于J Transl Med. 2021 Mar 12;19(1):104. 

Protein K和RNase A双酶消化进一步证实了Exosupur^®得到的RNA更多的是来源于囊泡，而囊泡外的游离RNA检测值更低。

Exosupur^®分离的外泌体进行蛋白质组研究时，可检测到丰富的囊泡特异的标志物蛋白，表明外泌体纯度高，可以更多检测外泌体来源的蛋白；可检测到比较多的蛋白数量，有利于不同样本之间的差异分析；与已发表文章、数据库具有较多overlap，表明数据可靠，能够准确的对外泌体蛋白进行研究。

对比不同的SEC分离方法：经过Exosupur^®试剂盒收集的馏分，具有最高的荧光强度（A)和最低的蛋白质浓度（B和C），表明Exosupur^®具有最有效的EVs回收率和最低的游离蛋白质污染。

Q：该试剂盒分离外泌体需要自备的内容有哪些？

A：

1．无菌PBS溶液(须用0.22μm滤膜过滤，建议新鲜配置或采购已过膜的PBS，4°C冰箱保存的PBS溶液需先平衡至室温)；

2．20%无水乙醇(须超声条件脱气20min或配置好后静置过夜)；

3．超滤管(截留分子量100kD)；

4．收集管(1.5mL EP管和15mL离心管)；

5．样品(上样前需平衡到室温，单根柱子单次上样体积为1mL)。

Q：如果是0.5ml左右的血浆样本应该用哪一款试剂盒？

A：直接稀释到1ml上样到Exosupur^® ES9P11e/ES9P14e 1ml血浆排阻柱

Q：Exosupur^® 微量血浆/清排阻柱的上样0.2ml指的是原始血浆/血清吗？

A：指的是经过低速离心和过0.45 μm滤膜处理后的样本，0.2ml。请注意滤膜过滤会损失约100 μl。如果只用0.2ml血浆进行滤膜过滤建议客户再用约100 μl PBS进行二次过膜润洗。

Q：样本收集完了，颜色还在中间，是否有问题？

A：按照操作说明来做，就没问题，一般是颜色滞后，因为颜色都是小分子成分，会靠后出来，外泌体会先流出，故不能以颜色作为外泌体收集的判断。

Q：用完了是直接用封闭液冲洗，还是2部体积的PBS冲了再用1倍体积封闭液冲？

A：如果本次接着用就不用封闭液清洗；如果本次不用了，需保存起来下次用，那么本次就用PBS冲洗后再封闭液冲洗。

Q：分离后的外泌体如何保存
A：外泌体保存问题跟分离方法无关，是由其本身特性决定的，如果条件允许最好使用新鲜的外泌体进行实验，冻存的外泌体容易产生团聚并出现沉淀。实际研究中，外泌体功能实验往往需要大量的外泌体不得不分批提取保存时可-80℃保存；但做biomarker研究时，如RNA组学等，提取外泌体后需尽快完成RNA提取等后续实验。